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研究

生物物理学

生物物理学使用物理学的理论、技术和仪器,定量地深入了解生物的结构、系统和功能。另外,生物物理学还充分利用这些获得的知识,研制供医学、机器人学和纳米技术领域使用的新设备。

生物物理学越来越多地在分子水平上对单个分子或复合物、这些物质的相互作用及其动力学进行研究。例如,研究领域涵盖分子结构、分子自组装、运动性、神经网络、分子发动机和电生理学。当前已经出现了一套描述生物物理学研究领域的术语,如生物能量学、生物力学、生物分子流体动力学和生物光子学。

由于生物物理学研究主要集中在分子水平上,因此显微镜,尤其是共聚焦显微镜就成为了非常重要的研究工具。用其可以观察多维分子的相互作用、动力学和定位。GFP 和其他荧光探针只需使用一套实验装置就可以观察多种分子。使用光谱成像和 FLIM 等技术,荧光发射光谱可被清楚地分开。

生物物理学使用的关键显微镜技术包括荧光成像、共聚焦成像、光谱成像、扫场共聚焦、TIRF、FRET/BRET、FRAP、反卷积、深层细胞成像和延时成像。

细胞培养和维持

随着人们对细胞研究的兴趣日益增加,尤其是对活细胞研究兴趣的增加,细胞培养正成为一门独立的学科。在培养基中生长的原核和真核细胞均可用于各种细胞的检测与研究,如细胞在低、中、高通量环境中的生长、分化、形态、凋亡、蛋白质表达、药物定位、毒理学和作用机理。再生医学中的干细胞培养是一个非常重要的细胞培养应用。

随着对细胞研究的兴趣日益增加,尤其是对活细胞研究兴趣的增加,细胞培养在成为一门独立的学科。在培养基中生长的原核和真核细胞均可用于各种细胞的检测和研究,如细胞在低、中、高通量环境中的生长、分化、形态、凋亡、蛋白质表达、药物定位、毒理学和作用机理。再生医学中的干细胞培养是一个非常重要的细胞培养应用。

可靠的细胞研究结果始自于健康的细胞和尽可能均匀的细胞群,对大型研究来说尤其如此。为使细胞具有理想的健康状况,可模仿其体内环境来维持细胞培养条件,保护细胞免受污染或感染。即使温度、湿度和 CO2 浓度发生微小的变化也会影响细胞的生长。现在有多种细胞培养舱、细胞培养皿和生长培养基,让细胞在特定的和严格控制的条件下生长。

定期观察培养基中的细胞在监控细胞健康状况和生长阶段中是非常重要的。细胞培养使用的显微镜成像方法通常包括明视场、暗场、相差、尼康先进的调制对比 (NAMC) 和/或 DIC。不过,为了观察而从培养舱中取出细胞,有可能会产生污染风险、环境应力和物理应力。当前,数个制造商已研发出加热式载物台和/或安装在显微镜上的防护罩,在成像期间专门用于降低环境应力。此外,尼康研发出了集培养舱和显微镜成像系统为一体的 BioStation,BioStation 在无需从培养舱中取出细胞的情况下就可以实现监控目的。

细胞信号传导

细胞信号传导技术是细胞内部和细胞之间控制和协调细胞活动的通信系统。更多地了解细胞信号传导与所有生物科学和医学的关系,有助于了解健康和患病的活性有机体是如何作用的。另外,了解这些有助于参与设计防治疾病的药物和探索工业上应用生物传感器的生物化学途径。

细胞信号传导技术是细胞内部和细胞之间控制和协调细胞活动的通信系统。更多地了解细胞信号传导与所有生物科学和医学的关系,有助于了解健康和患病的活性有机体是如何作用的。另外,了解这些有助于参与设计防治疾病的药物和探索工业上应用生物传感器的生物化学途径。

使用荧光显微镜,尤其是共聚焦荧光成像、光学切片、三维重建这些功能强大的技术,研究人员能够观察到细胞的内部情况和组织,在细胞内部和细胞之间识别和定位感兴趣的分子。遗传编码的 GFP 系列和化学探针分子荧光探针材料是观察所感兴趣分子或离子的关键。

通过活细胞成像技术可以长时间地直接观察信号传导事件,从而使研究人员在连续的时间和空间里进行监控成为可能。荧光探针 GFP 系列所取得的进展,使其能够监控蛋白质的表达、定位和示踪分子及识别分子间的相互作用。GFP 与钙结合蛋白作用后,也可以将许多细胞通信事件的核心,即钙信号传导事件转化为可见信号。关键成像技术包括 FRET、FLIM、TIRF、FRAP、FLIP 和 BRET。利用光谱成像功能,可以同时使用多个探针进行高分辨率识别。

图像来源:固定的小鼠大脑神经元 (eGFP)。东京大学医学研究院细胞神经生物学系 Satoru Kendo 博士。

化学生物学

化学生物学把化学和化学合成原理与生物学和生物合成融为一体。在化学应用方面,尤其在生物应用方面化学生物学尝试探索生物系统的详细功能以及控制和利用这些系统来改善或改变功能。

大量研究集中在活细胞蛋白质功能、亲和力和定位方面。化学合成技术可用来改变蛋白质,生成具有全新功能的新结构。专门设计的化学小分子也可以用来激活、抑制或增强体内蛋白质的功能,如可以用其设计新的疗法。其他主要研究领域包括金属在生物系统中的作用以及微管、特定糖分子和核酸等可控分子的组装过程。反之,了解这些组装过程后,通过提供化学合成骨架或模板可用来提高化学工艺。

化学生物学的基本组成部分是研究活细胞中的特定分子或离子,了解这些分子或离子的行为及其与其他分子的相互作用。显微镜检查,尤其是与荧光标记结合的多维共聚焦成像,是一种可视化单个分子和映射分子事件的重要方法。新型荧光探针的出现,如可光敏化的绿色荧光蛋白 (GFP)、kaede(枫)和量子点大大方便了分子示踪。

化学生物学使用的关键显微镜技术包括荧光成像、共聚焦成像、光谱成像、扫场共聚焦、TIRF、FRET/BRET、FRAP、反卷积、深部细胞成像和延时成像。

电生理学

所有活细胞和组织都具有 K+、Na+、Ca2+、K+ 和 Cl- 等离子运动产生的电学性质。借助能够激发和记录细胞膜电压或电流变化的微电极,可以对这些电学性质进行研究。研究包括计算整个器官的电活动,如心脏或细胞膜内的单离子通道。电活动的变化可能与机能活动有关,如大脑某个部位的机能活动、细胞膜信号活动或神经元触发行为。可以记录细胞外或细胞内的电活动。

电压钳、电流钳和膜片钳等细胞内记录技术均要求采用显微镜观察和显微操纵。这些技术包括使用细小的微量玻璃加液管(直径小于 1 μm)刺入细胞。显微操纵细胞的复杂性和(在许多情况下)刺入较厚组织的需要(如为了定位特定神经细胞),要求使用极其稳定的、不受电干扰影响的无振动显微镜。水浸物镜等高数值孔径的长工作距离物镜是深部成像及显微操纵设备和电极应用的关键。可用的成像模式包括明视场、暗场、共聚焦成像、DIC、IR-DIC 和荧光成像。使用活细胞则需要在显微镜上配置加热式载物台、组织/器官槽或其他形式的环境控制元件。

遗传学

遗传学是研究机体遗传和变异的科学。基因信息是存储在染色体内按照脱氧核糖核酸 (DNA) 分子结构编码的信息。基因是位于染色体特定位置上的 DNA 亚单位。它们对蛋白质或 RNA 分子等功能性产物进行精确编码,从而确定有机体表型(与环境因素有关)。单个基因可在转录的调控作用下生成多种产物。

光学显微镜技术在基因研究中发挥着核心作用,如为进行核型分析和 CGH 分析直接可视化染色体,使用 FISH 和 mFISH 技术识别固定和活细胞中的特定核酸序列。激光显微切割使研究人员能够从组织切片中分离出感兴趣的特定细胞用于 DNA 分析(在冷冻和固定切片以及细胞培养单层中)。对于来自同一组织标本的癌前期细胞、肿瘤细胞和正常细胞,这可能是一种识别其基因差异的有效方法。

在多种研究模型的帮助下,使用经典的正向遗传学或反向遗传学技术,可以更加深入地了解特定基因及其产物在决定表型过程中所扮演的角色。如斑马鱼、线虫(秀丽隐杆线虫)和果蝇(黑腹果蝇)等许多生物具有半透明的胚胎,使用光学显微镜可以观察这些活性有机体的发育情况。已知下游基因对器官发育过程中基因表达和基因突变的影响,可长时间地使用延时成像技术对其监控。此外,蛋白质表达和蛋白质定位也可以在共聚焦荧光显微镜下使用 FRET/BRET、FRAP、FLIP 和 FLIM 技术观察。使用 CALI 也可以在细胞中剔除选定的蛋白质功能,以便了解更多关于基因/蛋白质功能的信息。

在现今使用的许多基因技术中,如创造转基因生物和克隆,光学显微镜都是着非常重要的。高数值孔径和长工作距离的高质量物镜是显微操纵细胞转染和细胞核移植所需的元件。此外,研究核酸的物理性质也可以借助光钳等技术。

海洋生物学

海洋生物学是研究生活在世界海洋中的植物和动物的科学。分类的根据是这些生物的生活环境而不是这些生物本身。海洋生物学研究还与食品生产、医学、原材料、娱乐、气候与环境有关。

海洋生物学研究的领域非常广泛,涉及海洋病毒的识别与表征、细菌和浮游生物在海洋食物链中扮演的角色、海洋生物体的生物性发光、生活在极端环境(深度、压力、温度、盐度、暗度)中的有机体的自适应生物学、海洋生物的生态学与演化生物学以及海洋生物在监控污染和气候变化方面的应用。

使用各种生物化学、分子和细胞生物学技术,光学显微镜已成为观察和表征海洋生物活性有机体、固定组织和化石组织的基础工具。立体显微镜常用于在海水样本中快速观察有机体的领域,不过使用明视场、荧光、共聚焦、反射光、DIC 和其他相差技术的实验室方法,也可以用于研究活性和固定样本的详细结构和生理机能。偏光显微镜可以揭示硅藻和薄片状化石等有机体晶体结构中的细节信息。

分子病理学

传统病理学主要研究疾病的形态表现。此外,分子病理学集分子生物学工具为一体:分离和识别传染病病原体、了解不同基因表达在疾病病因学中的作用、提供更准确的疾病诊断方式和提供更个性化的治疗方法。

许多疾病都是由遗传性基因突变引起的,如囊性纤维化、肌肉萎缩和溶酶体贮积症。其他基因变化提高了患病的可能性,如癌症或心脏病。

为识别基因改变和疾病之间的关系,分子病理学使用的关键技术包括细胞分离和细胞培养、免疫组织化学、FISH 和实验室分子生物学技术(基因突变识别、表达谱、蛋白质分析、印迹、微阵列)。

人们认为恶性病的发展经历了不同的特定阶段,如增生、发育异常、原位癌、原发癌、外阴浸润癌和转移,每个阶段都与亚基因组表达的突变和改变有关。为分析基因,使用激光显微切割可从组织中分离出特定的细胞或细胞群(冷冻切片、固定切片和在细胞培养单层中),直接比较处于不同疾病发展阶段的细胞核酸。

基因改变对蛋白质功能和疾病影响的研究可采用多种成像技术进行。尤其重要的是,蛋白质间的相互作用成像使用延时成像技术,TIRF 显微镜检查以及三维渲染、FRET/BRET 等共聚焦荧光显微镜技术。这些技术使动态事件的时空分析成为可能,如受体相互作用和其他信号传导事件。

神经生物学

神经生物学是研究神经系统细胞(主要神经元和神经胶质细胞)及其进入功能回路后处理信息和调控行为的科学。神经元回路非常复杂,如人脑中有超过 1 亿个互联神经元。观察神经网络的一个难点是,单个神经元可能延伸至组织切片内,因而这样的神经元只能提供有限的信息。

使用共聚焦显微镜、光学切片和三维重建这些功能强大的技术,能够观察到延伸至脑切片和其他组织中的神经系统细胞。同样,使用水浸物镜等专门设计的深部成像技术可以获得更好的观察效果。

使用高分辨率光学显微镜(共聚焦、荧光和 DIC)和延时成像技术,在胚胎半透明的模式生物中可以观察脑组织发育和神经生长的情况。使用基因剔除和增强的基因表达技术,在诱导神经生长、突触形成、神经回路调节期间,可以研究特定的神经生长因子和其他信号分子。利用与强大荧光团有关的荧光技术,如可光敏化的 GFP、kaede、量子点,也可以研究细胞迁移情况。

微管组装及其与细胞膜的相互作用,将突触囊引导至突触。使用 TIRF 显微镜可以在约 50 – 100 nm 厚的原生质膜里直接观察微管功能和囊泡运动,同时可以使用共聚焦显微镜在微米级的范围内监控其运动。借助荧光/钙离子发光指示剂以及 FRAP 和 FLIP 技术,可以观察钙离子在调节突触传递中的运动模式,同时使用膜片钳电生理学可以记录穿过原生质膜的钙离子运动情况。此外,蛋白质间的相互作用可以释放出钙离子,使用 FRET 和 BRET 也可以监控这些钙离子。

植物学

植物学或植物科学是研究植物结构、繁殖、生长、代谢和疾病的科学。这一学科与一系列学科密切有关,如医药、食品生产、环境科学和许多材料供应(木材,木棉等人造纤维、纸张、亚麻布、生物燃料)。

植物学种可以使用多种不同的光学成像技术,从用于大体样本微观检查的立体显微镜检查技术到固定和染色植物切片的明视场以及用于活细胞成像的最新共聚焦技术。

GFP 与共聚焦和延时成像技术相结合,使研究人员能够随时识别和监控活细胞内的主要细胞组分。这种技术可用来研究对内部(如植物激素)和外部(如光、温度、化学物质)刺激有反应的特定植物结构生长、监控韧皮部和木质部运输、研究蛋白质和膜动力学作用(使用 FRET、FRAP 和 FLIP 等技术)、识别植物病毒、监控基因改变的影响、组织特异性基因的表达。光谱共聚焦成像对植物细胞成像特别有帮助,因为它能很容易地分辨探针发射的荧光和植物的自发荧光。

包括暗场、相差和 DIC 技术在内的其他可用技术,可以揭示未染色或轻度染色的活标本表面结构。偏光显微镜是观察晶体和高度有序植物结构的理想选择。

再生研究

再生研究的目标是研发受损组织和器官机能恢复的方法,如烧伤、创伤、脊髓损伤和骨折等意外伤害,以及糖尿病、帕金森病和其他退化性疾病。这些研究包括基于替换、修复、再生、重建或增强机能目的,将天然和合成组织和/或细胞植入身体。

再生研究可以使用细胞衍生疗法、干细胞疗法以及使用先进的生物材料用作组织工程学骨架和植入物。干细胞技术是再生研究的另一重点。通过在实验室培养的干细胞,希望能够生成组织特异性细胞,将其植入身体帮助修复器官或表达重要的蛋白质。不过,任何移植的组织或细胞都有被排斥的风险。不同于取自供体源的干细胞(成人或胚胎衍生细胞株),可以进行体细胞核移植或"治疗性克隆"以制造与潜在受体基因相匹配的干细胞。

多能干细胞可以在传代培养期间保持未分化状态,不过,在特异性细胞培养条件的诱导下却能分化为不同类型的组织。因此,干细胞培养需要仔细控制条件,增加相容和健康的细胞数量。明视场显微镜检查、暗场和相差等显微镜技术常用于监控培养基中细胞的生长。DIC、霍夫曼调制对比度和荧光(落射荧光和共聚焦)成像等技术可用于识别和表征干细胞。例如,使用免疫荧光技术能够可视化独特的干细胞标记物(受体和其他细胞表面特征)。另一种荧光方法是用细胞分化后闭合的 GFP 报告基因转染干细胞。

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